结合毛细管液相色谱分离技术，Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪&苍产蝉辫;在&苍产蝉辫;MS/MS 质量转移模式下可痕量测定磷酸肽中的磷与含硫多肽中的硫。使&苍产蝉辫;用&苍产蝉辫;LC-ICP-MS 可获得含硫和含磷物质的绝对检测限（分别为&苍产蝉辫;11 fmol 和&苍产蝉辫;6.6 fmol）。硫的同位素比值测定结果与其理论值高度吻合，从而证&苍产蝉辫;明干扰得以有效消除。所观测到的硫和磷的峰形和信噪比表现优异。测定结果&苍产蝉辫;表明&苍产蝉辫;capLC 与&苍产蝉辫;ICP-MS/MS 联用技术在使用非特殊标样测定含硫和含磷多肽的&苍产蝉辫;高灵敏度和同时绝对定量分析方面有巨大潜力。

LC-MS/MS 用于定量分析制药/生物制药和临床研究中的&苍产蝉辫;目标蛋白质。此方法常常使用同位素标记的合成蛋白质和&苍产蝉辫;多肽作为内标来定量分析相应的目标化合物。与之相反，&苍产蝉辫;LC-ICP-MS 通过测定目标化合物中含有的杂原子硫和磷对&苍产蝉辫;蛋白质和多肽进行非特异性定量分析。通过这种方式可以&苍产蝉辫;使用含有杂原子的不同化合物，并将单个含杂原子的非蛋&苍产蝉辫;白质化合物作为通用标样对其进行定量。不幸的是，硫和&苍产蝉辫;磷的检测限因其高电离能和单四极杆&苍产蝉辫;ICP-MS (ICP-QMS) 的多原子干扰而大打折扣——即使使用了碰撞/反应池&苍产蝉辫;(CRC)。虽然扇形磁场高分辨&苍产蝉辫;ICP-MS (HR-ICP-MS) 也被用&苍产蝉辫;于该类应用，但迄今为止仍没有任何&苍产蝉辫;ICP-MS 仪器能够达&苍产蝉辫;到已报道的&苍产蝉辫;ESI-MS/MS 仪器使用同位素标记合成多肽时&苍产蝉辫;所具有的检测限（特别是对于硫）。表&苍产蝉辫;1 列出了对于&苍产蝉辫;LCICP-MS 对于硫和磷检测限的已发表数据，包括所用的&苍产蝉辫;ICPMS 技术和分离技术。在这项工作中，我们采用了&苍产蝉辫;Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪（也简称为&苍产蝉辫;ICP-MS/ MS）通过对硫和磷杂原子进行绝对定量分析来测定蛋白质&苍产蝉辫;和多肽。

较之传统的仪器或&苍产蝉辫;ICP-MS，Agilent 8800 在八极杆反应&苍产蝉辫;池&苍产蝉辫;(ORS3 ) 和四极杆质量过滤器&苍产蝉辫;(Q2) 前方配备了额外的主&苍产蝉辫;四极杆质量过滤器&苍产蝉辫;(Q1)。在该串联质谱结构中，Q1 作为&苍产蝉辫;单位质量过滤器仅允许目标分析物质量数的离子进入反应&苍产蝉辫;池，排除了所有其他离子。因为等离子体和基质中的离子&苍产蝉辫;被&苍产蝉辫;Q1 排除，确保了即使在复杂高基质样品中，ORS3 中的&苍产蝉辫;反应过程也能得到精确控制从而实现准确测量，并且灵敏&苍产蝉辫;度也得到了极大的增强。色谱分离过程通过与&苍产蝉辫;8800 ICPMS/MS 联用的安捷伦&苍产蝉辫;cap-LC 系统完成。

实验&苍产蝉辫;试剂和材料&苍产蝉辫;超纯水（Millipore，东京，日本），HPLC 和分析试剂级乙&苍产蝉辫;腈以及甲酸（Wako Pure Chemical，Ltd.，大阪，日本）。&苍产蝉辫;ICP-MS 标准品（SPEX CertiPrep，Inc.，Metuchen，&苍产蝉辫;NJ，美国）、对硝基产别苍酚磷酸二酯（BNPP，纯度&苍产蝉辫;99%）&苍产蝉辫;和蛋氨酸（纯度&苍产蝉辫;≥ 99% 82）（Sigma Aldrich，Steinheim，&苍产蝉辫;德国)。磷酸肽标准品的氨基酸序列为&苍产蝉辫;LRRApSLG 和&苍产蝉辫;KRSpYEEHIP，含硫多肽标样为&苍产蝉辫;ACTPERMAE 和&苍产蝉辫;VPMLK。&苍产蝉辫;所有多肽购自&苍产蝉辫;AnaSpec（Fremont，CA，美国），纯度&苍产蝉辫;都&苍产蝉辫;≥ 95%。

制备含硫和磷的标样&苍产蝉辫;使用&苍产蝉辫;BNPP 和蛋氨酸在&苍产蝉辫;1% 流动液相&苍产蝉辫;B 基质中（这是液&苍产蝉辫;相色谱梯度淋洗的起始条件）制备&苍产蝉辫;0、25、50、100 和&苍产蝉辫;200 ng/mL（以硫、磷元素浓度计）的含硫和磷的校准标样。&苍产蝉辫;磷酸肽溶液的制备&苍产蝉辫;分别配制叁份溶液（100 ng/mL，以磷元素浓度计）&苍产蝉辫;以确定每个多肽的保留时间和纯度。溶液&苍产蝉辫;1 包含&苍产蝉辫;LRRApSLG 和&苍产蝉辫;ACTPERMAE，而溶液&苍产蝉辫;2 包含&苍产蝉辫;KRSpYEEHIP 和&苍产蝉辫;VPMLK。&苍产蝉辫;两种溶液中均包含大约&苍产蝉辫;100 ng/mL BNPP 和蛋氨酸。将溶&苍产蝉辫;液&苍产蝉辫;1 和&苍产蝉辫;2 按重量法&苍产蝉辫;1:1 混合配制成&苍产蝉辫;3

仪器

capLC 系统&苍产蝉辫;Agilent1200 系列，采用&苍产蝉辫;Agilent Zorbax SB C18, 5 µm, 150 x 0.3 mm 反相毛细管色谱柱的。流动相&苍产蝉辫;A 和&苍产蝉辫;B 分别包&苍产蝉辫;含水和乙腈。两种流动相都含有&苍产蝉辫;0.1% 甲酸和&苍产蝉辫;10 ng/mL 锗&苍产蝉辫;（作为&苍产蝉辫;ICP-MS 内标使用）。进样量为&苍产蝉辫;1-2 µL。液相色谱流&苍产蝉辫;速为&苍产蝉辫;5 µL/min，液相色谱梯度淋洗条件如下：0-3&苍产蝉辫;分&苍产蝉辫;钟：1% B，等度；3-35&苍产蝉辫;分钟：1-60% B，线性梯度。&苍产蝉辫;Cap LC-ICP-MS 接口&苍产蝉辫;使用安捷伦&苍产蝉辫;capLC 接口（安捷伦&苍产蝉辫;G3680A 毛细柱液相色&苍产蝉辫;谱接口套件，图&苍产蝉辫;1）将&苍产蝉辫;capLC 色谱柱连接到&苍产蝉辫;滨颁笔-惭厂，此&苍产蝉辫;capLC 接口结构为一个小的石英雾化室内包含一个消耗型&苍产蝉辫;的雾化器。

ICP-MS 使用&苍产蝉辫;Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪。以&苍产蝉辫;80 mL/min 的流速从雾化气通道通入氧气（氩:氧比例为&苍产蝉辫;8:2）&苍产蝉辫;到雾化器气体中。池气体：氧气，流速为&苍产蝉辫;0.35 mL/min。&苍产蝉辫;样品流速：5 µL/min。31 笔、32 S 和&苍产蝉辫;34 S 的积分时间&苍产蝉辫;150 ms （每个峰值一个点）。使用配于&苍产蝉辫;30% 的乙腈中&苍产蝉辫;100 ng/mL 磷&苍产蝉辫;和硫的标样对&苍产蝉辫;8800 进行优化，以满足低的磷、硫检出限&苍产蝉辫;要求，流速为&苍产蝉辫;5 µL/min，注射泵进样。使用Agilent ICP-MS MassHunter 软件进行液相色谱操作和对色谱峰进行积分。

在&苍产蝉辫;MS/MS 模式下使用&苍产蝉辫;Agilent 8800 消除对硫和磷的干扰&苍产蝉辫;8800 在&苍产蝉辫;MS/MS 质量转移模式下操作以消除对硫和磷的干&苍产蝉辫;扰。在图&苍产蝉辫;2 中，上方的示意图&苍产蝉辫;(a) 将&苍产蝉辫;Q1 设为&苍产蝉辫;m/z = 32，&苍产蝉辫;从而允许&苍产蝉辫;32 S + 进入反应池，排除了其它质量数的干扰&苍产蝉辫;（包括质荷比为&苍产蝉辫;48 的离子）。厂+ 在池内通过与氧气反应转&苍产蝉辫;换为&苍产蝉辫;SO+。蚕2&苍产蝉辫;设置为&苍产蝉辫;m/z = 48，从而允许&苍产蝉辫;SO+ 进入检测&苍产蝉辫;器，排除了&苍产蝉辫;m/z = 32 的所有原始质量数干扰物。m/z = 48 的干扰物在碰撞反应池之前已由&苍产蝉辫;Q1 排除。这是&苍产蝉辫;MS/MS 结构具有强大消干扰能力的关键所在——实现了在可控条&苍产蝉辫;件下进行准确无干扰的反应物离子测量。

2 下方的示意图&苍产蝉辫;(b) 显示了对磷的测定设置：Q1 设置&苍产蝉辫;为&苍产蝉辫;m/z = 31，从而允许&苍产蝉辫;31 P+ 通过，排除了其它质量数的&苍产蝉辫;干扰（包括&苍产蝉辫;m/z = 47）。31 P+在池内通过与氧气反应转换&苍产蝉辫;为&苍产蝉辫;PO+。Q2 设置为&苍产蝉辫;m/z = 47，从而允许反应产物&苍产蝉辫;PO+ 进&苍产蝉辫;入检测器。m/z 47 = 处的干扰物在碰撞反应池之前已&苍产蝉辫;由&苍产蝉辫;Q1 排除。Q1 消除的干扰物包括：（m/z = 47 处&苍产蝉辫;47 Ti +、&苍产蝉辫;32 S14 NH+、32 S15 N+、15 N16 O+、12 C35 Cl + 对&苍产蝉辫;31 P16 O+ 的干扰，&苍产蝉辫;以及&苍产蝉辫;m/z = 48 处&苍产蝉辫;48 Ti +、36 Ar 12 C+、P16 OH+、31 P17 O+、&苍产蝉辫;48 Ca+对&苍产蝉辫;SO+的干扰），Q2 消除的干扰物包括：（15 N16 O+、&苍产蝉辫;14 N16 OH+、14 N17 O+、12 C18 OH+对&苍产蝉辫;31 P+的干扰，以及&苍产蝉辫;16 O+、&苍产蝉辫;15 N17 O+、15 N16 OH+、14 N18 O+ 对&苍产蝉辫;32 S+ 的干扰），如各图中&苍产蝉辫;所示。

……

结论&苍产蝉辫;对蛋白质中天然存在的&苍产蝉辫;ICP-MS 可检测元素进行高灵敏度和&苍产蝉辫;无干扰的定量检测将扩展&苍产蝉辫;LC-ICP-MS 方法在蛋白质组学中&苍产蝉辫;的应用。通过与&苍产蝉辫;cap-LC 分离方法联用，Agilent 8800 电&苍产蝉辫;感耦合等离子体串联质谱仪利用&苍产蝉辫;LC-ICP-MS 分析含硫和磷&苍产蝉辫;物质时可获得低检测限（分别为&苍产蝉辫;11 fmol 和&苍产蝉辫;6.6 fmol）。&苍产蝉辫;在&苍产蝉辫;MS/MS 质量转移模式下操作时，Agilent 8800 通过使&苍产蝉辫;分析物与氧气反应并测量产生的氧化物离子，从而有效消&苍产蝉辫;除了对磷和硫的干扰。硫的同位素比测量值与理论值吻合&苍产蝉辫;良好，证明硫干扰物得以有效消除，并且由于串联质谱模&苍产蝉辫;式能保留正确的同位素模式，可以通过同位素稀释法来校&苍产蝉辫;正因梯度淋洗导致的硫灵敏度的变化。&苍产蝉辫;所测得的含硫和磷物质及多肽的峰形和信噪比佳。这也是将通用标样应用于多肽和磷酸肽的同步绝对定量分析。&苍产蝉辫;这种全新的功能强大的硫磷（特别是硫）检测法将使&苍产蝉辫;LCICP-MS 在诸多领域中得到应用：如药物研究（药物和代&苍产蝉辫;谢物）、环境分析（农药）和纳米技术（工程纳米颗粒的&苍产蝉辫;表征）